技术指标

外观:黄色无定型冻干粉末;蛋白纯度:≥90%;比活性:≥8 U/mg酶粉;过氧化氢酶:≤0.001%;胆固醇酯酶:≤0.01%;葡萄糖氧化酶:≤0.01%;ATP酶:≤0.005%

酶学性质

来源:微生物;分类:EC 1.1.3.6;分子量:60 kDa(SDS-PAGE);等电点:5.6;Km值:3.3×10-4 M(Cholesterol);抑制剂:SDS，Ag+，Zn2+，Hg2+;最适pH:7.0;最适温度:50℃;pH稳定性:5.5-10(25℃,16 h);热稳定性:40℃以下稳定（pH 7.0,30 min）;稳定性:-25～-15℃静置保存12个月保持90%以上活性;保护剂:BSA以及非离子型表面活性剂.

用途:用于高、低密度脂蛋白胆固醇试剂的研发和大量配制。

酶活定义

单位酶活定义为在下述条件下，每分钟催化生成1μmol H2O2所需的酶量。

试剂准备

试剂I：0.1 M磷酸钾缓冲液，pH 6.5。

试剂II：在500ml烧杯中加入5 mL Triton

X-100和0.5 g胆固醇，用保鲜膜密封，用微波炉加热至胆固醇完全溶解。缓慢加入90 mL双蒸水，加热并使其沸腾30-60s，溶液将变浑浊。用自来水淋洗使溶液冷却，冷却后的溶液会变澄清，若冷却后未变澄清则需要重新加热使其完全溶解。在澄清的溶液中加入0.4 g胆酸钠，用双蒸水定容至100 mL。定容后用0.22um滤膜过滤，此溶液在室温下一周内稳定。如果该溶液变浑浊，可轻微加热使其澄清。试剂III：纯水配制100 U/mL POD。

试剂IV：50 mM 4-AA溶液（1.016 g 4-AA溶于100 mL UP水）。

试剂V：50 mM TOOS溶液（1.477 g TOOS溶于100 mL UP水）。

酶稀释液：20 mM磷酸钾缓冲液，pH 7.0，含0.2%BSA。

样品：用酶稀释液将酶稀释至0.05-0.2U/mL。

按如下配制反应混合物：

试剂I:53 mL;试剂II:7 mL;试剂III:5 mL;试剂IV:3 mL;试剂V:3 mL;双蒸水:19 mL;共90 mL，可用于100次反应

操作步骤

1.将反应混合物置于37℃水浴锅预热；

2.向1 mL比色皿中加入0.9 mL反应混合物。

3.向反应混合物中加入0.1 mL待测酶液，混匀。

4.37℃反应，用分光光度计在555 nm检测样品1 min内的吸光度变化（ΔAs）

*用酶稀释液替代酶液，其它步骤相同，所得溶液吸光度为空白吸光度（ΔAb）ΔA=ΔAs-ΔAb